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本制品是由8条带状双链DNA条带组成的精准定量Marker，适用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中DNA条带大小和含量的分析。8条带的大小分别为10、15、20、25、30、40、50、100bp。其中25bp条带为加亮带，含量为100ng/5μL，其余条带浓度为50ng/5μL。

本制品为双链DNA Marker，适用于非变性的PAGE电泳和琼脂糖凝胶电泳，不适用于尿素PAGE电泳。由于片段很小，不建议用琼脂糖凝胶电泳分离。

• 制备凝胶步骤：
  
  • 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
    
  • 按照表一将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合；最后加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
    注：10bp DNA ladder适用于配制20%TBE-PAGE胶。
    
  • 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-2cm的无水乙醇，使凝胶表面保持平整。
    
  • 静置10～20分钟，待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合
    表一：TBE-PAGE分离胶配方表(总体积5mL，适用于1mm厚度小板胶)
    

    最佳DNA分离范围	凝胶浓度	灭菌水	30% PAA(29:1)	5×TBE	10% APS	TEMED
    70～450bp	6%	3mL	1mL	1mL	50μL	5μL
    60～460bp	8%	2.66mL	1.34mL
    50～300bp	10%	2.33mL	1.67mL
    40～200bp	12%	2mL	2mL
    25～150bp	15%	0.5mL	2.5mL
    5～100bp	20%	0.66mL	3.34mL

    
    
  • 去除覆盖在分离胶上的乙醇；按照表二将不同体积成分在一个小烧杯或试管中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
    表二：TBE-PAGE 4%浓缩配方表(总体积1.5mL，适用于1mm厚度小板胶)
    

    凝胶浓度	灭菌水	30% PAA(29:1)	5×TBE	10% APS	TEMED
    4%	1mL	0.2mL	0.3mL	20μL	2μL

    
    
  • 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
    
  • 静置30～60分钟，等待浓缩胶聚合。
    注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
• 电泳：
  
  • 将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入1×TBE电泳液，1mL吸头冲洗加样孔1～2次。
    
  • 取待测样品，加入相应体积6×Native PAGE DNA上样缓冲液，如5μL样品加1μL上样缓冲液，短暂离心后取5～10μL上样。10bp DNA ladder 1mm厚10齿梳子上样5μL，其余梳齿和厚度凝胶适量调整上样量。
    
  • 连接电源线，打开电源开关。200 V稳压电泳，至溴酚蓝指示前沿距离玻璃下沿1cm时结束电泳。
    

    TBE-PAGE电泳
    恒电压	起始电流	结束电流	电泳时间
    200 V	20～25 mA/板胶	10～15mA/板胶	＞50min

    
    
    图1．20%T3.3C TBE-PAGE
• 染色：
  
  • 漂洗：玻璃板上拆下凝胶后，适量蒸馏水漂洗3～5分钟。
    
  • 染色液配制：
    TBE-PAGE胶可以使用EB或RealGood类染料后染染色，以下程序用RealGood Red核酸染料（货号：RFT232）进行染色。即用型染色液配制：
    

    成分	用量
    1×TBE	100mL
    RealGood Red核酸染料	20μL

    
    
  • 染色和观察：
    凝胶浸泡于即用型染色液中，常温避光摇床40～60rpm染色30分钟。紫外光下观察。
• 实验示例：
  
  图2．20％TBE-PAGE电泳
  左1-7：10、15、20、25、30、40、50bp
  右1：10bp DNA ladder
  凝胶长度8cm
  电压200 V起始电流25 mA，终止电流13 mA
  电泳缓冲液：1×TBE
  电泳时间：50分钟
  染色：RealGood Red核酸染料后染30分钟